Salmonella spp. Методы лабораторной диагностики в ФГБУ «Краснодарская МВЛ»

По вопросом сдачи проб и анализов обращаться по телефонам:

Постоянный рост у населения числа острых кишечных заболеваний вынуждает контролировать пищевые продукты и сырье на возможность их загрязнения патогенными микроорганизмами, в частности бактериями рода сальмонелла (Salmonella spp.). Сальмонеллез – широко распространенное пищевое заболевание с фекально-оральным механизмом передачи. Он относится к наиболее опасным кишечным инфекциям человека и сельскохозяйственных животных. У человека сальмонеллез проявляется в виде пищевых токсикоинфекций, сопровождающихся воспалением слизистой оболочки тонкой кишки (энтероколит) и обезвоживанием организма. Загрязненные пищевые продукты, сырье, а также вода рассматриваются как основные источники и факторы передачи возбудителя. В 2006–2009 гг. в странах ЕС выявлено достоверное увеличение числа случаев обнаружения сальмонелл в мясе птицы. Ежегодно в США заболевание регистрируется у 1,4 млн. жителей, а материальные затраты, связанные с последствиями и профилактикой болезни, оценивается в $1-2,3 млрд. В России эта болезнь в структуре острых кишечных инфекций занимает второе место.

Сальмонеллы относятся к наиболее опасным возбудителям кишечных инфекций человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ВОЗ в мире каждый год регистрируется до 1,3 млрд. случаев сальмонеллеза, при этом динамика заболевания населения имеет тенденцию к росту. При отсутствии эффективного лечения летальные случаи у людей составляют от 1-3 до 10-15%.  По данным мониторинга, сальмонеллы обнаруживаются в 80–100% проб сточных вод мясоперерабатывающих предприятий и в 33–95% проб очищенных сточных вод. В воде открытых водоемов и почве бактерии сохраняются до 4–9 мес. Наличие сальмонелл в воде или почве всегда свидетельствует о загрязнении этих сред испражнениями инфицированных людей или животных – птиц, крупного рогатого скота, свиней, кошек, собак, голубей, рыб, черепах, рептилий. Инфицированность сальмонеллами отдельных групп этих животных колеблется от 6–7 до 80%. В пищевое сырье и корма бактерии попадают с загрязненной почвой или водой. Из загрязненного сырья патоген переходит в пищевые продукты. Загрязненные птицепродукты, мясо и мясные продукты, молоко, сыр, сливочное масло, овощи и фрукты, полуфабрикаты и приправы (майонез, яичный порошок, кремы и др.), а также питьевая вода – основные источники сальмонеллеза. Пищевые продукты контаминируются бактериями также в процессе кулинарной обработки, контактируя с бактерионосителями, производственным оборудованием, животными-переносчиками (мухи, мышевидные грызуны, комнатные животные). Продолжительность жизнеспособности сальмонелл зависит от вида продукции и среды обитания. Так, бактерии выживают: на поверхности овощей и фруктов в течение 5–10 дней, в молоке – 20 дней, в пиве и кефире – 2 мес., в колбасных изделиях и мясе (включая соленое) – 2–6 мес., в сливочном масле – 4 мес, в сырах – 1 год, в замороженном мясе – 2–3 года. Одним из факторов передачи возбудителя человеку, является способность бактерий развиваться в тканях яичников кур и инфицировать яйца при отсутствии клинических признаков патологии у животных – носителей инфекции. Сальмонеллы хорошо переносят низкие температуры и высушивание, выдерживают нагревание при 75°С в течение 30 мин. Соление и копчение продуктов практически не влияют на их жизнеспособность. Инфекционная доза сальмонелл определяется возрастом и состоянием организма хозяина, а также видом (подвидом) патогена и его устойчивостью к различным факторам (антибиотикам и др.). По одним данным эта доза составляет всего 15–20 клеток на человека, по другим – более 100 тыс. клеток. Известны случаи заболевания сальмонеллезом и даже вспышки заболевания среди населения, когда заражающая доза не превышала нескольких десятков бактерий.

Род сальмонелла относится к семейству Enterobacteriaceae. Бактерии палочковидные, грамотрицательные, аспорогенные, преимущественно подвижные. Во всем мире сальмонелла является одним из наиболее распространенных возбудителей пищевых отравлений, инфицирующих большинство видов сырых продуктов (например, мясо, яйца, растительные продукты). Устойчивость бактерий к высушиванию в сочетании с их высокой термостойкостью создает проблему защиты от патогена большинства сухих и полусухих продуктов. Согласно законодательству в сфере питания большинства стран содержание сальмонеллы не допускается в 25 г пищевого продукта. Для получения простого ответа (да/ нет) о наличии сальмонеллы в пище и кормах при использовании традиционных микробиологических методов необходимо в общей сложности затратить до 5 дней. Для продуктов, нуждающихся в быстрой реализации, это означает значительную задержку. Для удовлетворения требований производителей продуктов питания относительно быстрой реализации готовой продукции и снижения затрат на ее хранение необходимо использовать инновационные ускоренные методы обнаружения сальмонеллы. Таким образом, ускоренные методы анализа сальмонелл вызывают все больший интерес. Экспресс-тесты, предлагаемые для этих целей, должны быть специфичны, чувствительны, удобны и экономически эффективны. В зависимости от количества исследуемых образцов и требований к специфичности метода выбор может быть сделан либо в пользу молекулярного анализа бактериальной ДНК методом ПЦР (как правило, для высокопроизводительной лаборатории), либо в пользу иммунодиагностических тестов (при анализе меньшего количества образцов).

Клетки сальмонеллы – это подвижные (благодаря жгутикам), аспорогенные грамотрицательные прямые палочки (0,5–1х1–3 мкм) с закругленными концами. Встречаются также неподвижные особи и штаммы. Капсулу не образуют, факультативно-анаэробные хемоорганотрофы с окислительным и бродильным метаболизмом. Хорошо растут на простых питательных и желчесодержащих средах. На плотных средах могут образовывать колонии в R-форме (шероховатые) и S-форме (гладкие), на жидких дают диффузное помутнение. Колонии в S-форме средних размеров, блестящие, полупрозрачные, с голубоватым оттенком. При посеве крови лучшими жидкими средами обогащения является желчный бульон, при посеве биоматериалов (фекалии, желчь, моча), содержащих дополнительную флору, селенитовый бульон. На лактозосодержащих дифференциальных средах бактерии образуют бесцветные колонии, на висмут-сульфитном агаре – колонии черного цвета.

Важную роль играет специфическая профилактика сальмонеллезов, заключающаяся в проведении ветеринарно-санитарных, санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий. Профилактика сопровождаются перманентным контролем возбудителя в пище, фураже, сырье и воде.

Классическая методика исследования сальмонелл с использованием питательных сред - забуференная пептонная вода, среда Раппапорта-Вассилиадиса, селенитовая среда, тетратионатный бульон, ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар, бриллиантовый зеленый агар, висмут-сульфит агар. Однако, из-за длительности процедуры анализа для определения патогена одного классического метода недостаточно.

Альтернативные (ускоренные) методы. Для ускорения выявления сальмонелл, значительного сокращения трудозатрат и экономии ресурсов в последние десятилетия за рубежом разработаны, испытаны и широко применяются альтернативные (ускоренные) методы выявления возбудителя. Многие из этих методов официально рекомендованы в РФ и широко используются.

1) Модифицированные питательные среды- MSRV агар, Рамбах-агарXLT4 агар.

2) Иммуноанализатор mini VIDAS

Иммуноанализатор mini VIDAS - бактериологический автоматический анализатор для быстрого обнаружения патогенов в продуктах питания, кормах и образцах окружающей среды.

miniVIDAS - мультипараметрический автоматический иммуноанализатор, основанный на технологии ELFA (энзим-связанный иммунофлюоресцентный анализ). Данная технология позволяет определять аналиты с высокой чувствительностью (превышающей на несколько порядков чувствительность ИФА) и позволяет значительно снизить время проведения анализа. Время проведения большинства тестов не превышает 30 минут.

Концепция Vidas основана на максимальной надежности: никаких пробирок, которые могут протечь, никаких игл, способных засориться или вызвать перекрестную контаминацию, никакой работы с бьющимися сосудами. Устройство конус/стрип - полностью запечатано, что исключает необходимость ежедневной очистки прибора и дополнительное обслуживание. Метод измерения - фермент-зависимый флюоресцентный анализ, обеспечивающий отличную чувствительность и специфичность результатов.

Анализ проводится в индивидуальных пластиковых стрипах. Все реактивы, необходимые для проведения анализа в нужном количестве, концентрации и молярности, находятся в герметически закрытых лунках стрипа. Нет необходимости приобретать никакие дополнительные реактивы, ни реакционные кюветы, ни наконечники для прибора, а также никакие промывочные, останавливающие и др. растворы.

Контроль качества постоянно подтверждается на национальном и международном уровне, а также международными обзорами.

Предусмотрен и постоянный автоконтроль для прибора. После окончания анализа результаты распечатываются автоматически. Для качественных тестов дается интерпретация полученного значения флюоресценции, для количественных - цифровое значение результата.

Singlepath-Salmonella - Экспресс-тест

3) Иммунохроматографи­ческие экспресс-тесты

Экспресс-тесты Singlepath®-Salmonella в течение ряда лет успешно применяются для сертификации пищевой продукции в микробиологических лабораториях Роспотребнадзора и независимых лабораториях. Принцип селективного определения сальмонелл с использованием экспресс-тестов Singlepath®-Salmonella основан на реакции антигенов сальмонелл с высокоспецифичными антителами теста. После этапа селективного обогащения на среде Раппопорта–Вассилиадиса (RVS) проба термически инактивируется, после чего в объеме 0,16 см3вносят в лунку тест-планшета. Содержащиеся в пробе антигены сальмонелл взаимодействуют с моноклональными антителами экспресс-теста, образуя окрашенный комплекс антиген–антитело, выявляемый визуально.

4) Исследования с помощью микробиологического анализатора Dupont Qualicon BAX Q7


Анализатор BAX Q7 может определять микроорганизмы в продуктах питания и пробах окружающей среды в автоматическом режиме. Высокая скорость и легкость управления сочетаются с отличными эксплуатационными характеристиками, позволяющими оперативно получать точные и надежные результаты. Принцип действия BAX Q7 основан на использовании для скрининга проб метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени», позволяющей получить миллионы копий целевого фрагмента ДНК, если таковой присутствует в реакционной среде. Пользователь получает однозначные ответы, не требующие интерпретации специалиста, типа «да» или «нет» в течение 2-5 часов после начала анализа. Преимуществом этого анализатора является значительное сокращение числа ручных операций, сводя к минимуму возможность контаминации и обеспечивая достоверные результаты, за счет использования компьютерных алгоритмов анализа. Пользователь просто загружает подготовленные образцы, запускает программу и считывает результаты с экрана.